Лечение Американского гнильца пчел
Paenibacillus larvae bacteriophages: obcure, promosong, future
(адаптация статьи на русский язык)

Paenibacillus larvae является грамположительной спорообразующей бактерией, и вызывает заболевание, именуемое американским гнильцом (American Foulbrood, AFB), самого разрушительного бактериального заболевания пчелы. P. larvae устойчива к антибиотикам, что затрудняет лечение. Зараженная личинка разлагается в коричневую жидкость вязкой консистенции, которая постепенно высыхает с образованием чешуек, содержащих миллионы спор [1, 4]. Споры распространяются вокруг улья рабочими пчелами, что вызывает массовую инфекцию. Споры P. larvae чрезвычайно долговечны, остаются инфекционными в течение десятилетий и легко распространяются ветром и при обмене материалом между ульями [1, 5].

В настоящее время единственным методом борьбы со вспышками AFB является массовое сжигание ульев, что ложится тяжелым финансовым бременем на пчеловодов [1]. В связи с этим, бактериофаги, способные уничтожить P. larvae, быстро становятся перспективным средством лечения AFB. Первые фаги P. larvae были выделены в 1950-х годах, но поскольку P. larvae в то время не был устойчив к антибиотикам, интерес к фагам оставался скудным.

Интерес к фагам P. larvae быстро рос с момента, как в 2013 году был секвенирован первый геном фагов P. larvae. С тех пор число секвенированных геномов фагов P. larvae достигло 48 и будет расти дальше.

Все секвенированные фаги P. larvae кодируют консервативную N-ацетилмурамоил-L-аланин амидазу, которая ответственна за расщепление пептидогликановой клеточной стенки P. larvae. Все фаги P. larvae также кодируют интегразу, эксцизионную гидролазу или Cro/CI, что указывает, что они являются умеренным фагами.

В последние несколько лет было опубликовано несколько исследований по использованию фагов P. larvae и амидазы фагов P. larvae в качестве лечения AFB. Исследования проводились на зараженных личинках in vitro, а также на ульях в полевых условиях.

Фаги оказывают как профилактическое действие, предотвращая инфекцию, так и лечебный эффект, помогая устранить инфекцию. Фаги P. larvae имеют узкий ареал, лизируя только P. larvae, и не способны лизировать даже родственные виды Paenibacillus. Таким образом, фаги P. larvae, по-видимому, безопасны в использовании и эффективны в качестве лечения AFB, и интерес к ним в ближайшие годы будет продолжать расти.

Историческая справка

Первые фаги P. larvae были выделены в 1950-х годах Н. Смирновой в Ленинградском ветеринарном институте, Россия (из мертвых личинок) [15] и T.A. Gochnauer в Министерстве сельского хозяйства Канады (из лизогенных культур) [16]. Еще несколько изолятов были охарактеризованы в исследованиях в Северной Америке и на Востоке, но в то время не было секвенировано ни одного фагового генома, поскольку секвенирование генома было либо недоступным, либо чрезмерно дорогим. Более того, в то время AFB регулярно лечили антибиотиками, и поэтому интерес к фагам P. larvae оставался скудным. Ситуация начала меняться с появлением устойчивых к антибиотикам штаммов P. larvae в начале 2000-х годов.

Первым фагом P. larvae, геном которого был секвенирован, был phiIBB_Pl23, выделенный в Португалии в 2013 году [26], за которым последовал фаг HB10c2 в Германии в 2015 году [27] и фаги Diva, Lily, Rani, Redbud, Shelly, Sitara и Tripp, выделенные в Северной Каролине [28, 29]. В то же время 30 фагов P. larvae были выделены в университете штата Невада, Лас-Вегас, США (University of Nevada, LasVegas (UNLV), USA); последовательности генома 9 из них были опубликованы в 2015 году [30].

Одновременно большое количество фагов P. larvae было выделено студентами BrighamYoung University (BYU) в штате Юта, США, в период 2014–2016 гг в рамках курса BYU «Охотники за фагами», и геномы 26 из них были опубликованы в 2018 году [31, 32]. В эту группу входит фаг PBL1c, выделенный из лизата Dingman et al. в 1984 году [22] и направленный в BYU для секвенирования в 2016 году [31]. Еще четыре генома фагов из UNLV были опубликованы в 2018 году [33], в результате чего число опубликованных геномов фага P. larvae достигло 48. Первый сравнительный анализ геномов фага P. larvae был опубликован в 2016 году [34], после чего в 2018 году был проведен всесторонний геномный анализ 48 секвенированных геномов фагов [35].

Жизненный цикл

Все известные фаги P. larvae – умеренные фаги; до настоящего времени не было обнаружено чисто литических фагов P. larvae. Кроме того, нет никаких известных чисто лизогенных фагов P. larvae: все изолированные фаги P. larvae способны лизировать своего хозяина in vitro. Тем не менее, существует широкий разброс в литической способности различных фагов P. larvae. Некоторые фаги, такие как Halcyone, FernиWillow, являются литическими по отношению ко всем штаммам P. larvae, тогда как другие, такие как Xenia, являются литическими к одному штамму, но не способны лизировать другие [36]. Разрыв клетки обычно наступает с ~125 фаговых частиц на инфицированную клетку-хозяина [27].

Фаги P. larvae имеют узкий круг хозяев; они не способны лизировать бактерии, тесно связанные с P. larvae, такие как Paenibacillus alvei и Paenibacillus polymyxa [36], хотя фаг HB10c2 проявил ограниченную литическую активность в отношении некоторых других представителей рода Paenibacillus [27]. Узкий диапазон хозяев является важным фактором для использования фагов в качестве лечения AFB, поскольку это указывает на то, что фаги P. larvae вряд ли могут повредить важную флору кишечника пчелы.

Лечение AFB

С 2015 года было опубликовано несколько исследований, посвященных использованию фагов P. larvae для лечения AFB [27, 36, 49] у личинок, выращенных in vitro и в ульях [49]. В двух из этих исследований личинки медоносных пчел, зараженные спорами P. larvae и впоследствии обработанные фагами, имели значительно более высокую выживаемость, чем зараженные личинки, которые не обрабатывались фагами [36, 49]. В одном исследовании три из наиболее сильных литических фагов (Fern, Willow и Xenia) использовались отдельно друг от друга [49]; в другом исследовании использовался коктейль из семи фагов [36].

В обоих исследованиях фаги также оказывали профилактическое действие; личинки, которые были обработаны фагами и впоследствии заражены P. larvae, имели значительно более высокую выживаемость, чем инфицированные контрольные личинки, которые не обрабатывались фагами [36, 49]. В одном из исследований профилактическое лечение привело к значительно более высокой выживаемости по сравнению с постинфекционным лечением [49].

Важно отметить, что оба исследования показали, что фаги не оказывали неблагоприятного воздействия на личинки медоносных пчел или микробиоту их кишечника: незараженные личинки пчел, подвергшиеся воздействию фагов, имели очень сходные показатели выживаемости в сравнении с контрольными личинками [36, 49].

Фаги были высокоспецифичны для P. larvae и не могли лизировать даже близкородственные виды бактерий, такие как Paenibacillus lentimorbus, Paenibacillus popilliae, Paenibacillus polymyxa и Paenibacillus alvei [36]. Однако в другом исследовании фаг HB20c2 не улучшал выживаемость инфицированных личинок несмотря на то, что он лизировал P. larvae in vitro [27]. Возможные причины этого могут заключаться в том, что фаг вступает в лизогенез или неспособен получить доступ или проникнуть в P. larvae в кишечнике пчелы [27]. Все вышеперечисленное говорит о том, что фаговые коктейли могут быть использованы для лечения AFB.

Первое использование фагов в полевых условиях для лечения AFB было опубликовано в 2017 году [50]. Всего было выделено 39 фагов, 3 из которых были отобраны на основании их литических профилей для использования в лечебном фаговом коктейле. В предварительных испытаниях было показано, что фаги безопасны для использования; у здоровых ульев, к которым был применен фаговый коктейль, смертность не была значительно выше, чем у контрольных ульев.

Однако пчелы в здоровых ульях, получавших фиктивное лечение, имели значительно более высокую смертность, чем пчелы из контрольных ульев. В последующих испытаниях фаговый коктейль наносили профилактически на пять незараженных ульев и на пять ульев в контрольной группе, получавшей фиктивное лечение. Через 2 недели четыре из пяти ульев в контрольной группе были заражены AFB, тогда как пять ульев, обработанных фагом, оставались здоровыми. После того, как коктейль фагов был нанесен на зараженные ульи, пчелы из четырех из них полностью выздоровели в течение 6 недель. Результаты этого исследования показывают, что фаги P. larvae оказывают как профилактическое, так и лечебное действие на пчел, инфицированных AFB [50].

Учитывая, что P. larvae является грамположительной бактерией, другой возможностью является использование амидазы для лечения AFB [46]. В исследовании 2015 года амидаза фага Xenia была выделена, клонирована и использована для лечения личинок медоносных пчел, инфицированных P. larvae [47]. Через 8 дней инфицированные личинки, которых лечили амидазой, показали выживаемость 75% по сравнению с выживаемостью в 90% в контрольной группе и 20% – в зараженной, но не получавшей лечение группе [47]. Амидаза была очень эффективна при лизировании генотипов ERICI P. larvae, но не ERICIII и ERICIV, точно так же, как это было обнаружено с фагомXenia [47]. Важно отметить, что амидаза была высокоспецифична для P. larvae, демонстрируя лишь незначительный лизис родственных штаммов, таких как P. polymyxa и P. lentimorbus, и не обладала литической активностью в отношении любых других видов бактерий [47]. Преимущество использования одной амидазы вместо фага заключается в том, что P. larvae намного труднее избежать амидазы по сравнению с уходом от фагов. Бактерии могут уклоняться от фагов, приобретая последовательности CRISPR или мутации в своих рецепторах, но для уклонения от амидазы потребуется мутация в пептидогликане, что является гораздо более сложной задачей.

Выводы

В последние годы растет интерес к фагам, которые способны уничтожить P. larvae, бактерию, ответственную за разрушительное заболевание AFB у пчел. Фаги P. larvae были впервые выделены в 1950-х годах, а первый секвенированный геном появился в 2013 году. С тех пор число секвенированных фагов P. larvae возросло до 48, и, учитывая потенциал фагов для лечения AFB, это число еще вырастет в ближайшие годы.

Фаги P. larvae геномно разнообразны, по геномному сходству распределены на четыре кластера и один синглет. Один кластер очень большой, содержит большинство фагов P. larvae (Fern), другой кластер содержит только два фага (Harrison), третий кластер неоднороден (Vegas), в то время как четвертый кластер очень далек от всех других (Halcyone). Размер генома составляет от 35 до 56 т.п.н., а содержание G+C – от 40 до 49 mol%. Кластерные фаги Halcyone имеют значительно более длинные геномы и более высокое содержание G+C и используют другую стратегию упаковки ДНК, чем другие фаги P. larvae. Кластеры различны, с небольшим сходством последовательностей между ними. Текущая картина систематики сильно отличается от той, что была в 2016 году [34], и, несомненно, снова изменится в будущем. Географическое происхождение не коррелирует со схожестью последовательностей. Фаги P. larvae лизируют своего хозяина с помощью консервативной N-ацетилмурамоил-L-аланин амидазы, которая была идентифицирована у всех фагов, и чья функция была подтверждена экспериментально. N- ацетилмурамоил-L-аланин амидазы распределяются в два отдельных кластера, один из которых содержит кластерные амидазы Halcyone, а другой - остальные. Различия в аминокислотной последовательности амидазы, вероятно, объясняют различия в литических профилях фагов.

Все известные фаги P. larvae являются умеренными фагами, и было показано, что фаги P. larvae эффективны в борьбе с AFB как in vivo, так и в полевых условиях, без какого-либо заметного вреда для пчел.

В отличие от антибиотиков, фаги вряд ли представляют угрозу для пчел и здоровья человека.

Также было показано, что амидаза фагов P. larvae эффективна при AFB (без необходимости в использовании фагов).

Поскольку альтернативных методов не хватает, а AFB продолжает оставаться глобальной проблемой, фаги P. larvae потенциально могут стать одним из основных методов борьбы с AFB в будущем, и интерес к ним, несомненно, будет продолжать расти. Тем не менее, требуется дополнительная работа для установления эффективности и безопасности использования фагов P. larvae и фаговых амидаз в борьбе с AFB в полевых условиях.

Направления, представляющие интерес:

— определение функции большего количества фаговых белков P. larvae;
— точное определение механизмов, с помощью которых фаги P. larvae лизируют бактериальные клетки;
— роль кодируемых фагом токсинов в резистентности и вирулентности P. larvae к антибиотикам;
— механизм проникновения фагов P. larvae в клетку;
— механизмы, с помощью которых фаги P.larvae начинают и заканчивают лизогению;
— возможность использования фаговых белков в биотехнологии;
— понимание того, как личинки P. larvae защищаются от заражения фагами.

2. Genersch E, Ashiralieva A, Fries I. Strain- and genotype-specific differences in virulence of Paenibacillus larvae subsp. larvae, a bacterial pathogen causing American foulbrood disease in honeybees. Appl Environ Microbiol 2005;71:7551–7555.

3. Yue D, Nordhoff M, Wieler LH, Genersch E. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the interactions between honeybee larvae and Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood of honeybees (Apis mellifera). Environ Microbiol 2008;10:1612–1620.

4. Lindstrцm A, Korpela S, Fries I. The distribution of Paenibacillus larvae spores in adult bees and honey and larval mortality, following the addition of American foulbrood diseased brood or spore-contaminated honey in honey bee (Apis mellifera) colonies. J Invertebr Pathol 2008;99:82–86.

5. Hasemann L. How long can spores of American foulbrood live? Am Bee J 1961;101:298–299.

6. Evans JD. Diverse origins of tetracycline resistance in the honey bee bacterial pathogen Paenibacillus larvae. J Invertebr Pathol 2003;83:46–50.

7. Murray KD, Aronstein KA. Oxytetracycline-resistance in the honey bee pathogen Paenibacillus larvae is encoded on novel plasmid pMA67. J Apic Res 2006;45:207–214.

8. Miyagi T, Peng CYS, Chuang RY, Mussen EC, Spivak MS et al. Verification of oxytetracycline-resistant American foulbrood pathogen Paenibacillus larvae in the United States. J Invertebr Pathol 2000;75:95–96.

9. Tian B, Fadhil NH, Powell JE, Kwong WK, Moran NA. Long-Term exposure to antibiotics has caused accumulation of resistance determinants in the gut microbiota of honeybees. mBio 2012;3:e00377-12.

10. White GF. The Bacteria of the Apiary with Special Reference to Bee Disease, Technical Series no. 14. Washington, DC: Bureau of Entomology, USDA; 1906.

11. Katznelson H. Bacillus pulvifaciens (n. sp.), an organism associated with powdery scale of honeybee larvae. J Bacteriol 1950;59:153–155.

12. Ash C, Priest FG, Collins MD. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test. Antonie van Leeuwenhoek 1994;64:253–260.

13. Heyndrickx M, Vandemeulebroecke K, Hoste B, Janssen P, Kersters K et al. Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus) pulvifaciens (Nakamura 1984) Ash et al. 1994, a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White 1906) Ash et al. 1994, as a subspecies of P. larvae, with emended descriptions of P. larvae as P. larvae subsp. larvae and P. larvae subsp. pulvifaciens. Int J Syst Bacteriol 1996;46:270–279.

14. Genersch E, Forsgren E, Pentikдinen J, Ashiralieva A, Rauch S et al. Reclassification of Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation. Int J Syst Evol Microbiol 2006;56:501–511.

15. Smirnova NI. Isolation and the use of a bacteriophage of Bacillus larvae in the diagnosis of American foulbrood. Sbornik nauchnykh trudov Leningradskogo instituta usovershenstvovaniya veterinarykh vrachel 1953;9:85–88 (in Russian).

16. Gochnauer TA. The isolation of a bacteriophage (bacterial virus) from Bacillus larvae. Bee World 1955;36:101–103.

17. Gochnauer TA, L’Arrivee JCM. Experimental infections with Bacillus larvae. II. Bacteriophage production in the host. J Invertebr Pathol 1969;14:417–418.

18. Gochnauer TA. Some properties of a bacteriophage from Bacillus larvae. J Invertebr Pathol 1970;15:149–156.

19. Valerianov T, Popova A, Toshkov AS. Isolation from the soil of a bacteriophage lysing Bacillus larvae. Acta Microbiol Virol Immunol 1976;4:81–85.

20. Drobnнkovб V, Ludvнk J. Bacteriophage of Bacillus larvae. J Apic Res 1982;21:53–56.

21. Benada O, Ludvнk J, Drobnнkovб V. Morphology of a new bacteriophage isolated from Bacillus larvae. Folia Microbiol 1984;29:520–521.

22. Dingman DW, Bakhiet N, Field CC, Stahly DP. Isolation of two bacteriophages from Bacillus larvae, PBL1 and PBL0.5, and partial characterization of PBL1. J Gen Virol 1984;65:1101–1105.

23. Bakhiet N, Stahly DP. Properties of clear plaque mutants of the Bacillus larvae bacteriophages PBL0.5 and PBL2. J Invertebr Pathol 1988;52:78–83.

24. Campana CF, Bakhiet N, Stahly DP. Morphology of Bacillus larvae bacteriophage PBL3 and physical map of its DNA. J Invertebr Pathol 1991;57:141–143.

25. Stahly DP, Alippi AM, Bakhiet N, Campana CF, Novak CC et al. PPL1c, a virulent mutant bacteriophage useful for identification of Paenibacillus larvae subspecies larvae. J Invertebr Pathol 1999;74:295–296.

26. Oliveira A, Melo LDR, Kropinski AM, Azeredo J. Complete genome sequence of the broad-host-range Paenibacillus larvae phage phiIBB_Pl23. Genome Announc 2013;1:e00438-13.

27. Beims H, Wittmann J, Bunk B, Sprцer C, Rohde C et al. Paenibacillus larvae-directed bacteriophage HB10c2 and its application in American foulbrood-affected honey bee larvae. Appl Environ Microbiol 2015;81:5411–5419.

28. Carson S, Bruff E, DeFoor W, Dums J, Groth A et al. Genome sequences of six Paenibacillus larvae Siphoviridae phages. Genome Announc 2015;3:e00101-15.

29. Abraham J, Bousquet A-C, Bruff E, Carson N, Clark A et al. Paenibacillus larvae phage Tripp genome has 378-base-pair terminal repeats. Genome Announc 2016;4:e01498-15.

30. Tsourkas PK, Yost DG, Krohn A, LeBlanc L, Zhang A et al. Complete genome sequences of nine phages capable of infecting Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood disease in honeybees. Genome Announc 2015;3:e01120-15.

31. Walker JK, Merrill BD, Berg JA, Dhalai A, Dingman DW et al. Complete genome sequences of Paenibacillus larvae phages BN12, Dragolir, Kiel007, Leyra, Likha, Pagassa, PBL1c, and Tadhana. Genome Announc 2018;6:e01602-17.

32. Merrill BD, Fajardo CP, Hilton JA, Payne AM, Ward AT et al. Complete genome sequences of 18 Paenibacillus larvae phages from the western United States. Microbiol Resource Announc 2018;7:e00966-18.

33. Yost DG, Chang C, LeBlanc L, Cassin E, Peterman C et al. Complete Genome Sequences of Paenibacillus larvae Phages Halcyone, Heath, Scottie, and Unity from Las Vegas, Nevada. Microbiol Resour Announc 2018;7:e00977-18.

34. Stamereilers C, LeBlanc L, Yost D, Amy PS, Tsourkas PK. Comparative genomics of 9 novel Paenibacillus larvae bacteriophages. Bacteriophage 2016;6:e1220349.

35. Stamereilers C, Fajardo CP, Walker JK, Mendez KN, Castro-Nallar E et al. Genomic analysis of 48 Paenibacillus larvae bacteriophages. Viruses 2018;10:377.

36. Yost DG, Tsourkas P, Amy PS. Experimental bacteriophage treatment of honeybees (Apis mellifera) infected with Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood disease. Bacteriophage 2016;6:e1122698.

37. ICTV taxonomic proposal 2016.017a-dB. A.v1. Harrisonvirus: create genus Harrisonvirus in the family Siphoviridae, order Caudovirales; 2016. http:// www. ictv. global/ proposals- 16/ 2016. 017a- dB. A. v1. Harrisonvirus. pdf

38. ICTV taxonomic proposal 2016.052a-dB. A.v1. Vegasvirus: create genus Vegasvirus in the family Siphoviridae, order Caudovirales; 2016. http:// www. ictv. global/ proposals- 16/ 2016. 052a- dB. A. v1. Vegasvirus. pdf

39. Salisbury A, Tsourkas PK. A method for improving the accuracy and efficiency of bacteriophage genome annotation. Int J Mol Sci 2019;20:e3391.

40. Merrill BD, Ward AT, Grose JH, Hope S. Software-based analysis of bacteriophage genomes, physical ends, and packaging strategies. BMC Genomics 2016;17:679.

41. Casjens SR, Gilcrease EB. Determining DNA packaging strategy by analysis of the termini of the chromosomes in tailed-bacteriophage virions. In: Clokie MRJ, Kropinski AM (editors). Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 2: Molecular and Applied Aspects (Methods in Molecular Biology series vol. 502). New York: Humana Press; 2009. pp. 91–111.

42. Young RY. Bacteriophage lysis: mechanism and regulation. Microbiol Rev 1992;56:430–481.

43. Wang I-N, Smith DL, Young R. Holins: the protein clocks of bacteriophage infections. Annu Rev Microbiol 2000;54:799–825.

44. Young I, Wang I, Roof WD. Phages will out: strategies of host cell lysis. Trends Microbiol 2000;8:120–128.

45. Oliveira A, Leite M, Kluskens LD, Santos SB, Melo LD et al. The first Paenibacillus larvae bacteriophage endolysin (PlyPl23) with high potential to control American foulbrood. PLoS One 2015;10:e0132095.

46. Santos SB, Oliveira A, Melo LDR, Azeredo J. Identification of the first endolysin cell binding domain (CBD) targeting Paenibacillus larvae. Sci Rep 2019;9:2568.

47. LeBlanc L, Nezami S, Yost D, Tsourkas P, Amy PS. Isolation and characterization of a novel phage lysin active against Paenibacillus larvae, a honeybee pathogen. Bacteriophage 2015;5:e1080787.

48. Kelley LA, Mezulis S, Yates CM, Wass MN, Sternberg MJE. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc 2015;10:845–858.

49. Ghorbani-Nezami S, LeBlanc L, Yost DG, Amy PS. Phage therapy is effective in protecting honeybee larvae from American foulbrood disease. J Insect Sci 2015;15:84–89.

50. Brady TS, Merrill BD, Hilton JA, Payne AM, Stephenson MB et al. Bacteriophages as an alternative to conventional antibiotic use for the prevention or treatment of Paenibacillus larvae in honeybee hives. J Invertebr Pathol 2017;150:94–100.

51. Huson DH, Bryant D. Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Mol Biol Evol 2006;23:254–267.

52. Cresawn SG, Bogel M, Day N, Jacobs-Sera D, Hendrix RW et al. Phamerator: a bioinformatic tool for comparative bacteriophage genomics. BMC Bioinformatics 2011;12:395.

53. Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer EL. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. J Mol Biol 2001;305:567–580.

Назад